Koje se metode mogu koristiti za proučavanje interakcija protein-protein?
Za proučavanje interakcija protein-protein može se koristiti nekoliko metoda. Evo nekoliko često korištenih tehnika:
1. Koimunoprecipitacija (Co-IP) :Co-IP je široko korištena tehnika za proučavanje interakcija protein-protein. Uključuje imunoprecipitaciju jednog proteina (proteina mamca) iz staničnog lizata pomoću antitijela specifičnog za protein mamca. Imunoprecipitirani proteinski kompleks zatim se analizira kako bi se identificirali drugi proteini (proteini plijena) koji su u interakciji s proteinom mamca. Co-IP može biti praćen raznim nizvodnim metodama analize, kao što je Western blot, masena spektrometrija ili imunofluorescentno bojenje.
2. Paući testovi :Pull-down testovi temelje se na principu afinitetne kromatografije. Protein mamac je imobiliziran na čvrstoj podlozi (kao što su magnetske kuglice ili agarozna smola) kovalentnim vezanjem ili fuzijom s oznakom (npr. GST ili His-oznakom). Stanični lizat ili pročišćena proteinska smjesa zatim se inkubira s imobiliziranim proteinom mamca. Nakon ispiranja radi uklanjanja nevezanih proteina, proteini u interakciji (proteini plijena) se eluiraju i analiziraju.
3. Fluorescencijski rezonantni prijenos energije (FRET) :FRET je tehnika koja mjeri prijenos energije između dva blisko razmaknuta fluorofora (donora i akceptora). Kada su donorski i akceptorski fluorofori u neposrednoj blizini (obično unutar 10-100 Å), ekscitacija donorskog fluorofora rezultira emisijom svjetlosti akceptorskog fluorofora. Ovaj prijenos energije može se kvantificirati i koristiti za praćenje interakcija protein-protein. FRET se može implementirati na različite načine, uključujući označavanje proteina specifičnim fluoroforima ili uporabom genetski kodiranih fluorescentnih proteina (npr. GFP i RFP).
4. Analiza biomolekularnih interakcija (BIA) :BIA, također poznata kao površinska plazmonska rezonancija (SPR), tehnika je bez naljepnica koja mjeri promjene u indeksu loma na sučelju predmetnog stakla i tekućine koja teče. Jedan od proteina koji su u interakciji imobiliziran je na površini stakla, a drugi protein prolazi preko površine. Interakcija između proteina dovodi do promjena u indeksu loma, koji se mogu otkriti i kvantificirati. BIA može pružiti informacije o afinitetu vezanja i kinetici interakcija protein-protein.
5. Izotermalna titracijska kalorimetrija (ITC) :ITC je tehnika koja mjeri promjenu topline povezanu s interakcijom između dviju molekula. Kada proteini međusobno djeluju, toplina se ili oslobađa (egzotermno) ili apsorbira (endotermno). ITC može kvantificirati afinitet vezanja (Kd) i termodinamičke parametre, kao što su promjena entalpije (ΔH) i promjena entropije (ΔS), interakcija protein-protein.
6. Nizovi interakcija proteina :Nizovi interakcija proteina uključuju visokoučinkoviti pregled interakcija protein-protein u formatu mikronizova. Tisuće različitih proteina ili peptida imobilizirano je na čvrstu površinu, a vezanje specifičnog proteina od interesa detektira se pomoću obilježenih antitijela ili drugih metoda detekcije. Ova tehnika omogućuje brzu i široku analizu interakcija protein-protein.
7. Dvohibridni (Y2H) test kvasca :Y2H test je genetska metoda koja se koristi za identifikaciju protein-protein interakcija u stanicama kvasca. Uključuje spajanje kodirajućih sekvenci dvaju proteina u dvije različite domene transkripcijskog faktora. Ako dva proteina stupaju u interakciju, faktor transkripcije se rekonstituira, što dovodi do ekspresije reporterskog gena. Pozitivne interakcije identificiraju se na temelju rasta stanica kvasca na selektivnim medijima ili kolorimetrijskim testovima.
Izbor metode za proučavanje interakcija protein-protein ovisi o specifičnim proteinima od interesa, dostupnosti reagensa i opreme te željenoj razini informacija. Kombinacije ovih tehnika također se mogu koristiti za dobivanje sveobuhvatnog uvida u interakcije protein-protein.
