Površini stanice biotinilacija Protokol
biotinilacija koristi sposobnost topiv biotina vežu na stanične proteine . Biotin se veže na protein streptavidina i , prema tome , korisna u staničnoj biologiji se vizualiziraju staničnih proteina . Biotinilacija omogućuje sigurnu označavanje proteina u odnosu na tehnike , kao što su radioaktivnosti i ne utječe na staničnu normalnu funkciju . To vam znanstvenici proučavati stanične proteine poput receptora , a koji omogućuje bolje razumijevanje bolesti i bolesnih procesa . Označavanje suspendiranim stanicama
Stanice su ispirane u ledeno - hladnog fosfatnog pufera ( PBS) za uklanjanje onečišćenja . Odbojnici sadrže tris i glicin će se natjecati s biotinilaciji i treba izbjegavati . Da bi se izbjegla biotiniliranje interne proteine ,označavanje se može izvesti , na 4 stupnjeva Celzijusa ili u prisutnosti azida . Stanice ponovno suspendiraju u PBS i topljivog biotina , sulfo - NHS - LC - biotin .
Označavanje adherentne stanice
Stanice su ispirane u PBS-om i inkubiraju se s proizvodom , kao što su sulfo - NHS - LC - biotin . Stanice su zatim struganje u posudu i razgrađene u spremnik koji sadrži deterdžent Tritona -X 100 i priprema za vizualizaciju .
Priprema označenim stanicama
Slijedeći inkubacije , stanice su centrifugirane u pelete i isprana u PBS . Stanice se resuspendiraju u PBS-u i očisti s IgG sefaroza gelu . Vezani protein je razrijeđen u puferu za punjenje te zagrijava do 100 stupnjeva Celzijusa .
Vizualizacija stanice
Razrijeđena proteini mogu se vizualizirati pomoću natrij dodecil sulfat poliakrilamid gel elektroforeze ( SDS - PAGE ) zatim s upijanjem proteina i enzima mix , streptavidin - hren peroksid . Mrlje su vizualizirani s kemijskom reakcijom --- kemiluminescencije --- koja emitira svjetlost . Specifičnost biotinilaciji mogu potvrditi antitijela za proteinom u studiji .
