Unutarstanični Bojanje Protokol za protočnu citometriju
protočnom citometrijom je sredstvo koje je korisno u proučavanju staničnih proteina . Ona koristi emisiju svjetlosti ili fluorescencije iz proteina unutar stanice . Antitijela ili sonde označene s fluorescencije koristi za proučavanje specifičnih proteina . Protočna citometrija se koristi za dijagnosticiranje nekoliko bolesti, uključujući rak , već je također korisno u medicini. Fiksiranje stanica
Stanice treba pričvrstiti na održavanje stabilnosti unutarstanične proteine . Brojni fiksativi može se koristiti kao što je formaldehid ili ledeno - hladnom acetonu . Sljedeći fiksacije ,stanične membrane treba omogućiti permealizedantitijela ući u stanicu . Detergenti kao Triton i NP-40 , ili ledenog metanola mogu se upotrijebiti kako bi se rupe u staničnoj membrani .
Bojenja
Ispiranje stanica u puferu za blokiranje 0,5 posto albumina goveđeg seruma razrijeđen u fosfatnoj puferiranoj fiziološkoj otopini , BSA /PBS . Stanice su inkubirane u puferu za blokiranje da se smanji nespecifično vezanje . Dodavanje primarnog antitijela razrijeđena u puferu za blokiranje i ostaviti da se inkubira na sobnoj temperaturi , za optimizirani duljinu vremena . Operite s blokiranjem tampon .
Analiza
Inkubira sekundarni antitijela , koja je označena sa fluorescentne oznake , na sobnoj temperaturi 30 minuta . Da bi se uklonila pranje antitijela stanice u blokiranju tampon . Spin stanice u pilula i onda resuspendirajte u PBS i analizu na protočnom citometru .
