Kako provesti FRET analiza

prijenosa fluorescentne rezonantne energije ( FRET ) jetest tehnika za mjerenje prisutnosti i količine vezanja između dva proteina reporter - povezani . Ovaj test se obično koristi za analizu potencijalno obvezujuće proteine ​​u razne tipove stanica i mjeriti učinkovitost konjugacija tipa enzima . Oprema za otkrivanje potrebno u velikoj mjeri ovisi o vrstama reporter molekula koji se koriste , iako je mnogo putajednostavno 96 - te čitač pločica mogu se koristiti . Ono što vam treba
Protein-of-interest/Reporter molekule konstrukata za svaki protein koji se ispituje
96 jažica bloka
96 i čitač ploče pregled reakcijskom puferu ( Tris - ili općenito fosfata bufferom - slane - based )
Konjugacija enzima ( ako je potrebno )
Prikazati više uputa
postavljanje i čitanje
1

Roditi ili pripremiti spojenih konstrukata svakog proteina od interesa , međusobno povezan s fluorescencijom prijenosne molekule , kao što su zeleni fluorescentni protein ( GFP ) , rodamin ili bor - dipyrromethene ( biodipi ) .
2

Određivanje apsorbancije i emisije valnih duljina od svake komponente i fluorescentne ukupni test . ( Na primjer , ako je test mjeri GFP -> prijenos Rodamin fluorescentne energije ,ulaz apsorbancija valna duljina je da je GFP apsorbancije ( 488 nm ) , a emisijska valna duljina za detekciju da za rodaminom ( 595 nm ) )
.
3

Stvoriti odgovarajući tampon reakcije za eksperiment , ovisno o proteina od interesa je biokemijskih svojstava . Tris - pufer temelji se često koristi , uključujući i kalcijevog klorida i 0,05 posto Tween - 20 . Specifične koncentracije i komponente mogu se odrediti u potrazi za navoda pojedinostima slične reakcije i uvjete .
4

Pomiješati dva reporter - konjugiranog proteina od interesa u različitim koncentracijama u reakcijskom puferu , a alikvoti 50-200 ul po jažici . Dodavanje konjugacije enzima (na primjer , sortase ) za svaki uzorak i , ako je potrebno . Ako se obavlja je krajnja točka testa , omogućuju inkubacije pri sobnoj temperaturi ( ili enzim optimalno temperatura) u određenom vremenskom razdoblju , tada pročitati na 96 - jažica čitaču . Ako obavljanja kinetike testa , izravno nastaviti s čitanjem ( vidi dolje ) .
5

Insert uzorak ploču u 96 posudica čitatelja . Stvoriti novi eksperiment stranicu i pristupiti izborniku postavki . Ulaztočne apsorpcija ( uzbude ) i valne duljine emisije , a zatim odaberite odgovarajuće bunara treba čitati .

Ako obavljanja kinetike eksperiment , postavili vremenski tijek eksperimenta i Očitanja interval razdoblje ( kao što je jednom svaka 10 minuta ) .

početi čitati uzorak .

analizirati podatke korištenjem Microsoft Excel grafičkim funkciju ( ili neki drugi grafički program, kao što su GraphPad ) .