Kako Test nukleinskih kiselina

Ispitivanje nukleinskih kiselina se provodi u medicinskoj dijagnostici , kako bi se otkrile patogena, poput virusa ili bakterije . Ti testovi su puno brži i , stoga , omogućit liječnika započeti liječenje pacijenta koji inače ne bi morali čekati na potvrdu infekcije koristeći više duge i naporne probe antitijela - based . Proces je također poznat kao pojačavanja nukleinske kiseline, ispitivanja , i uključuje postupak poznat kao " obrnuti transkriptaze pojačanje " lančanom reakcijom polimeraze . Budući da je ovovrlo specijalizirani znanstveni postupak , napredno znanje i stručnost u tehnikama molekularne biologije i teorija je potrebno . To je ono što vam je potrebno
PCR cijevi
PCR biciklista
vrpci i filter savjeta
Rukavice
Stanice
Trizola ili drugi RNA vađenje reagensa
PCR pufer
Taq polimeraze
RT - PCR početnice u koncentraciji od 1 mg /ml
RNaza-slobodne vode
dNTP

nasumičnih početnika MgCl2 1,8 mg /ml koncentracije
Superscript II reverzna transkriptaza

Prikaži više uputa
prerada i priprema u RNK
1

Harvest stanice sa RNK ekstrakcije reagensa , kao što Trizola . 1 ml , je dovoljna za prikupljanje stanica za jednu jamicu šest - jažičnoj ploči tkivne kulture . Stanice su temeljito pipetira gore i dolje kako bi ih se homogenizira i potom provesti postupak za ekstrakciju kao što je opisano u podatkovne tablice Trizol . Ukratko , ekstrahira kloroformom , a zatim centrifugiranjem razdvajanja faza DNA , RNA i proteina . Obnova samo bezbojni fazu RNA i talog koji izopropanclom . Nakon inkubacije , centrifuga, to i počistiti rezultiralo kuglica s nekoliko etanol pere . Zatim resuspendira peleta u RNaza - slobodne vode .
2

za reverznu transkripciju , denaturirati točno 5 mikrograma RNA na 65 stupnjeva Celzijusa u 10 mikrolitara (UL) volumenu RNaza - slobodne vode , zatim je brzo staviti na led . Za svaku reakciju , kombinirati 10 ul RNA , 3 ul 10x PCR reakcijski pufer , 2,5 jal 10 milimolarni dNTP , 6 L 25 milimolarni magnezij klorida , 1 ul nasumičnih početnika od 1,8 mg po mililitru koncentracije , i 0.5 ul eksponent II enzima reverzne transkriptaze . Nadopunite reakciju s 17 ul RNAzu - slobodne vode . Inkubirajte cijevi na sobnoj temperaturi deset minuta , a zatim na 42 Celzijevih stupnjeva tijekom jednog sata da se dobije cDNK , zatim denaturira pri 95 ° C, a brzo led da se zaustavi reakcija .
3

za lančanu reakciju polimeraze , ponovno postaviti reakcijske smjese u 0.5 ml epruvetama kombiniranjem 6 ul cDNA sastoji u reakciji reverzne transkripcije , 1.5 ul 10x PCR reakcijski pufer , 0,2 mikrolitru Taq polimeraze , 0,5 mikrolitru reverzni primer , a također za daljni primer , a zatim vrh se u svaku epruvetu s 10,3 ul RNaza - slobodne vode . Za pokretanje reakcije , postaviti termičkog ciklusa ( tj.stroj koji obavlja lančane reakcije polimeraze ) za 30 ciklusa na sljedeći način : 95 stupnjeva Celzija za 0.5 minute denaturirati , nakon čega slijedi 60 stupnjeva Celzija za 45 sekundi za kaljenje , i na kraju 72 stupnjeva Celzijusovih 1 minuta produljiti sintetizirani transkript .