QuickChange Mutagenesis Protokoli

QuickChange mutagcncza jebrand ime kit koji se koristi u istraživanjima biotehnologije izazvati genetske mutacije DNK ili mijenjati. Agilent Technologies jetvrtka iza proizvod , koji je dostupan u dvije verzije, QuickChange II i QuickChange munje . Oba setove sadrže tampon rješenje , enzim DNA polimeraze , reagense boja , sekvence ili primere, te uzorke stanica . Mutant Strand Sinteza Reakcija protokola

Tehničari sintetiziraju dvije oligonuklcotida ili kratka DNK sekvence sadrže željenu mutaciju . Zatim se pripremi kontrolnom reakcijom s DNA sekvenci , dNTP mix otopine i DNA polimeraza enzimom , dodavanjem destilirane vode . Kasnije , se pripremiti nizom reakcija uzoraka primjenom različitih koncentracija dvostruke uzvojnice DNA ( dsDNA ) , uz održavanje primer ili konstantna koncentracija oligonukleotida , u skladu s uputama proizvođača . Oni drže uzorke na 203 stupnjeva F za 30 sekundi . Uzorak koji sadrži DNK segment broj dva je također testira na temperature biciklizam , tehniku ​​gdje temperaturne promjene tijekom kratkog razdoblja vremena . Konačno , uzorci su stavljene na led tijekom dvije minute .

Dpn I digestije amplifikacijski produkti Protokola

Dpn I restrikcijskog enzima smanjuje DNA na specifičnim mjestima . Jedan mikro - litara tog enzima doda se izravno u svakoj reakciji amplifikacije ispod standardne mineralno ulje sloj pomoću mikro - pipetom ili specijalizirane aerosola otporan pipete . Međutim ,mineralno ulje prekrivanje je potreban samo ako termalni ciklički uređaj , uređaj se koristi za pojačavanje DNA segmenata , nema vrućeg gornji sklop . Reakcija je lagano miješaju i kasnije staviti u mikrocentrifugi za jednu minutu . Nakon toga , uzorci se inkubiraju pri 98,6 stupnjeva Celzijevih za jedan sat .
Transformacija XL1 - Blue Supercompetent stanica Protokol

XL1 - Blue jetetraciklina otporan na stanične linije koja dolazi s QuickChange mutageneznim setove . Tijekom tog protokola , tehničari topiti stanice , koje su prethodno bile čuvane na -112 stupnjeva Celzijevih , na led . Zatim su dodati jedan mikro litri Dpn I - tretiranog DNA , je zagrijavanje na 107,6 stupnjeva F 45 sekundi i reakcija se stavi na led kroz dvije minute . Nakon ovog postupka , tehničari dodati pripremu NZY ( kazein hidrolizata i ekstrakt kvasca ), predgrijan na 107,6 stupnjeva F i inkubira kroz jedan sat . Priprema se potom stavi na agar gel ploče i inkubiraju na 98,6 stupnjeva Celzijevih ili 16 sati .