Cell -based ELISA Protokol
ELISA , ili enzimski vezanog imunosorbentnog ispitivanja , se koristiti kao dijagnostički alat u medicini i u biološkim istraživanjima za određivanje količine specifičnog proteina . ELISA koristi antitijela za detektiranje proteina i reagens koji stvara boju . Količina boje odnosi se na količinu proteina . Kultura stanica Stanice
treba staviti u jažice u 96 - jažica s 100 mikro - litara medija za rast i stanice su ostavljene preko noći da se riješiti . Ako učite stanica, a reakciju na faktor , stanica mora biti serum izgladnjele za 24 sati , a zatim stimulirane s faktorom koje se istražuje .
Fiksacija i Osnovna Antitijela
Nakon uklanjanja medija , stanice se tretiraju sa fiksativom , kao što je 3 posto formaldehid , ili metanol . Stanične membrane treba učiniti propusnim kako bi se protutijelo prodrijeti u stanicu . Permeabilizacija se može postići uporabom 0,1 posto Tritonu , ako metanol ranije nije korišten . Nespecifično vezanje se može spriječiti uporabom 10 posto fetalnog telećeg seruma razrijeđenog u fosfatnom puferu . Nakon uklanjanja bloka ,primarno antitijelo može se primijeniti i inkubiraju tijekom jednog sata .
Sekundarnim protutijelom i mrlja
Uklanjanje primarnog antitijela , i za pranje tri puta . Dodavanje sekundarnog antitijela vezan na sredstvo za detekciju , kao što je hren peroksidaza . Inkubirati jedan sat . Dodaj Wash kemiluminiscentni substrat otopina . Razviti i skenirati ploču za intenzitet boje .
