Krioprezervacija Postupci

postupke zamrzavanja su oni koji dopuštaju da se stanice pohraniti beskonačno pomoću vrlo niske temperature suspendirati metaboličke aktivnosti . Postoje dvije glavne vrste postupaka zamrzavanja : ravnoteže ( konvencionalna sporo zamrzavanje ) i neravnotežne ili ultra - brzog zamrzavanja ( vitrifikacija ) . Izraz vitrifikacija dolazi odlat. " staklastog tijela " ili staklen . Oba postupka koriste vlaženja antifrizom tipa svojstvima kako bi se spriječilo oštećenje stanica tijekom smrzavanja . Nakon što su stanice zamrznuti ili vitrificirani , mogu biti pohranjeni u nedogled uranjanjem u tekućem dušiku , iznimno hladnog fluida sa temperaturom od -196 ° C ( -321 ° F). Vratiti metaboličke aktivnosti u stanici nakon odmrzavanja , toksični vlaženja treba ukloniti iz stanice , anormalna ravnoteža vode postupno obnovljena kaostanica se vraća na normalno funkcioniranje temperaturi . Pregled

Pregled

postupke zamrzavanje su oni koji omogućavaju stanicama da budu pohranjeni na neodređeno vrijeme pomoću iznimno niske temperature obustaviti metaboličke aktivnosti . Postoje dvije glavne vrste postupaka zamrzavanja : ravnoteže ( konvencionalna sporo zamrzavanje ) i neravnotežne ili ultra - brzog zamrzavanja ( vitrifikacija ) . Izraz vitrifikacija dolazi odlat. " staklovine " ili staklen . Oba postupka koriste vlaženja antifrizom tipa svojstvima kako bi se spriječilo oštećenje stanica tijekom smrzavanja . Nakon što su stanice zamrznuti ili vitrificirani , mogu biti pohranjeni u nedogled uranjanjem u tekućem dušiku , iznimno hladnog fluida sa temperaturom od -196 ° C ( -321 ° F). Za vraćanje metaboličku aktivnost u stanici nakon odmrzavanja , otrovne antifriza mora biti uklonjena iz ćelije i normalne ravnoteže vode postupno obnovljena kaostanica se vraća na normalno funkcioniranje temperaturi .
Cell - specifični faktori

postupak koristi za cryopreserve stanice ili tkiva ovisi o brojnim faktorima , uključujući veličinu stanice ,stanične količina tekućine ( citoplazmom) isloženost stanica ( stanice ili jednu tkiva ) . Stanice s velikom količinom citoplazmi , kao što su jaja teže cryopreserve od stanica sa samo preostalim citoplazmi , kao spermija . Zamrzavanje tkiva jajnika je veći izazov , jer su prisutni u tkivu jajnika , svaki s različitim optimalnim smrzavanja treba barem tri različite vrste stanica različitih veličina . Slow - zamrzavanje protokoli su se s uspjehom s različitim vrstama stanica . Vitrifikacija trenutno je najučinkovitiji s nule single- stanica i manje učinkovit s tkivima , ali istraživanje je u tijeku kako bi optimizirali vitrifikaciju tkiva .
Uloga krioprotektanti

citoplazmi stanica sadrži vodu, koja se pretvara da ledenih kristala na temperaturi smrzavanja . Kada Ice oblika unutar stanice ,stanica je isjeckan i umire . Dakle , tekućina u stanicama treba ukloniti prije postizanja niske temperature da se izbjegne oštećenje stanica . Različiti tipovi antifriz tekućine ( krioprotektantu ) može se koristiti da se dehidrirati stanica prije zamrzavanja , uključujući glicerol , propandiol , dimetil sulfoxde ( DMSO ) , etanola i šećere kao što su sukroza i trehaloza . Optimalna brzina hlađenja ( i otapanja ) ovisi o vrsti i o krioprotektantu koristi svojstvo stanice ili tkiva da se ( ili da je bio ) smrznuti . Vlaženja su toksični za stanice metaboliziraju do stanične izloženosti antifriza u toplijim metaboličkih temperaturama moraju biti minimizirane ili izbjegnute . Nakon odmrzavanja ili zagrijavanje stanica , antifriza mora biti potpuno ukloniti iz ćelije prije metabolička aktivnost ponovno uspostavljena .
Ravnoteža Versus neravnotežna zamrzavanje postupku

stopa od smrzavanja ovisi o tome je li protokolzamrzavanje je ravnoteža - ili ne- equilbrium - based . Za postupke tipa ravnoteže ,optimalna brzina smrzavanja se postiže kada postoji ravnoteža između brzinom kojomstanica se dehidrira vode i brzinom kojom voda izvan stanice se pretvara u fazi led . Ove ravnoteže ili sporo zamrzavanje protokoli obično potrajati satima za dovršetak iračunalo se koristi za pokretanje programirati stopa zamrzivač kako bi se osiguralo da se zamrzavanje cijene su točno koliko je potrebno. Tu je obično" držati " korak u protokolu blizini samog početka kako bi se omogućilo ručno stvaranje starter ledenih kristala ili " sjetva " u tekućini izvan stanica .

vitrifikacije ,posve drugačiji pristup smrzavanja koji se ne oslanja na rampi i postizanja ravnoteže između dehidracije i formiranja kristala leda koristi . Vitrifikacija je tako ultra - brz da nema dovoljno vremena za formiranje leda istanična tekućina se pretvara izravno u staklene ili staklene faze , bez oštećenja stanica . Programabilni stopa zamrzivači nisu potrebni jer jestanica izravno ušla je u iznimno hladnim tekućim dušikom , postizanje instinktivan staklastog stanja .
Slow - Freeze Postupak

prvi korak postupak sporo smrzavanja je izložiti stanicu za krioprotektantu postepenim stupnjevit način da bi se omogućilo polagano ekvilibracija stanice s krioprotektantu uz ispuštanje vode . Nakon što su stanice su očišćene od većine staničnih vode , stanice u krioprotektantu tekućine se stavi u spremnik od neke vrste , kao što su plastične slame , staklene ili plastične ampule vial.The volumena tekućine koja okružuje stanice za sporo zamrzavanje je obično manje od žličice i može biti samo nekoliko kapi . Prethodno obilježene punjenja spremnika , zapečaćena i stavi u zamrzivač , programabilni koji polako smanjuje temperaturu spremnika tijekom perioda od nekoliko minuta ili sati na vrlo niske temperature . Nakon nekoliko minuta hlađenja , starter ledenih kristala mora biti formirana u spremniku od strane " sijanje " spremnik . Zasijavanje se izvodi pomoću uređaja ( na primjer , hvataljke ) koji je prethodno ohlađena u tekućem dušiku na dodir spremnik i dovesti do stvaranja kristala leda . Ovaj starter kristalno će inicirati kontrolirano oblikovanje kristala leda na jednom mjestu , na sigurnoj udaljenosti od stanica . Nakon što je završena sjetva ,ostatak rampi hlađenje može nastaviti . Kadaspremnik dosegne temperaturu između -30 i -85 ° C ,posudu koja stanice mogu izravno uronjen u tekućem dušiku za dovršetakohladi na -196 ° C.

vitrifikacije

ultra - brze neravnotežnih hlađenje postupci kao što vitrifikacije koristiti veće koncentracije antifriza zajedno s gotovo trenutan stopi smrzavanja postići poniranja stanica izravno u tekući dušik . Vitrifikacije zaobilazi led - nastajanje kristala fazu i pomiče vodu izravno u staklastu fazu . Vitrifikacije postiže isti drugoj kao sporo zamrzavanje , a pri brzini od -3000C/min , u odnosu na 10C/min ili više . Za vitrifikacije , stanice obično se nalaze na vrhu na slamku i višak cryoprotectant je uklonjena , ostavljajući samo toliko dastanica oslanja na spremnik površinske napetosti , prije poniranja u tekućem dušiku . Jer je tako brzo zamrzavanje ,trajanje izloženosti antifriza je manje , i još mnogo više koncentracije krioprotektanti se mogu tolerirati stanica . Zagrijavanje stanici da ga se vrati u normalan metabolički rad mora biti nevjerojatno brz . Rukovanje vitrificirane uzoraka je mnogo više nego što iziskuje sporo zamrznutih uzoraka , jer čak ikratka izloženost temperaturi iznad koje tekućeg dušika može početi neplanirano proces zagrijavanja i refreezing , što je štetno za stanice .