Molekularno kloniranje Protokoli
Molecular Cloning protokoli obuhvaćaju postupke koji se koriste za definiranje , izoliranje i replicira DNA sekvencu . Tradicionalne restrikciju i ligaciju kloniranje protokoli pokretanje DNA fragmentacije s ograničenim endonukleazama ( enzimi koji režu , na lance DNA restrikcijskih mjesta ) , DNK fragment ligacija ( popravak prekida DNK molekulama ) transfekcije ( uvođenje nukleinske kiseline u stanice tijela ) i izbor (odabiranje pojedinih genoma za replikaciju ) . Izolacija
Protokoli za izolaciju DNA fragmenta , prvi korak u Molecular Cloning , često uključuju lančanu reakciju polimeraze ( PMR) , koja koristi ciklusa zagrijavanja i hlađenja pojačati dijelova DNA . Do veličine cilj sekvence , drugi protokoli uključuju DNA sonikacije, reakcijska enzimima i upotrebu kemijski sintetiziranih oligonukleotida . Ovi protokoli variraju ovisno o veličini i količini izolirana DNK potrebna .
Ligacijski
protokoli za podvezivanja uključiti pomoću enzima , ligaze , da se pridruže DNK molekule zajedno s kovalentna veza . Protokol nalaže kombinirajući DNK fragmente , kloniranje vektor, podvezivanja tampon , DNA Ugaze i sterilizirati vodu u mikrocentrifugnu cijevi i inkubaciju preko noći na 4 Celzijeva stupnja .
Transfection
protokoli za transfekciju , DNA ili infuzijom u stanicu pomoću ne- virusnih sredstava , često uključuju injektiranja DNK izravno u staničnu citoplazmu . Druge metode uključuju korištenje kemijskih reagensa , kao što su kalcij fosfat i lipidima , za isporuku transfekcijskog kompleks kroz staničnu membranu . Ova metoda ispitivanja učinaka gena modifikacije na funkcioniranje određenih gena .
Selection
izbor , ili screening , protokoli odrediti koje stanice su uspješno održana DNA ubačen i ukazuju koje stanice trebaju izolaciju . Centrifuga žetva stanica koje sadrže transfektirane DNA , koje se zatim inkubiraju u lizozima (prirodno enzima ) puferu i tretiran s alkalnim deterdžentom , dajući proteina membrane i topljivost . Korištenje acetat da se istaloži na proteine ,centrifuga i gaza filtrirati DNA sadrži supernatant (topive tekućine preostale iz centrifugira spoja ) . Supernatant se taloži sa polietilen glikolom , centrifugiraju , te suspendira u cezij klorida i etidij bromid pufera . Etidij bromid oboji DNA po gustoći , te pomoću dugovalnom UV svjetlo ,niži - band DNA se ekstrahira s pet cc brizgalicom . Ekvilibrirana kolonu s ionskom izmjenom odvaja DNA iz etidij bromida i cezijeva klorida , a konačni talog DNA je suspendiran u otopini pufera i detektirati na agaroza gel elektroforezom .
