T -stanične kulture Protocols

T - stanica , koji pripadaju obitelji imunosnih stanica zvanih limfociti , nastaju tijekom prilagodljivim imunološkim odgovorom . T - stanice koje potječu od matičnih stanica koštane srži i sazrijevaju u timusu . Postoji nekoliko različitih tipova T - stanica , svaki s različitim funkciju . T - stanice koje se razlikuju jedna od druge prema priloženom antigena T - stanica receptora . Podskup T - stanica CD4 nosi oznaku i pomaže da se izazove imuni odgovor . Izvora T -stanica

T - stanice mogu se dobiti iz različitih izvora , uključujući slezenu , limfne čvorove , timus i , ali periferne krvi najčešće raspoloživog izvora T - stanica za svrhe kulture . Uzorci krvi su temeljito prikazan za infekcije i drugih zagađivača i pažljivo postupati ispod sigurnosnog kabineta . T-stanice su uzgajane iz više razloga , uključujući i mjerenja toksičnosti i za studij imunološke reakcije cjepiva .
Izolacija

T-stanice obično su odvojeni od cjelovitih uzoraka krvi po gustoći - gradijent odvajanje , kao što je T - stanice su manje gustoće od crvenih krvnih stanica , kao što su eritrociti , pa ekstrahira centrifugiranjem . Prikladne neutralna otopina soli se dodaje u uzorak krvi , nakon čega slijedi Ficoll isopaque otopine . Ficoll isopaque ima gustoću veću od T - stanica , ali manje od eritrocita i tijekom centrifugiranja čini srednji sloj između oba stanica , čime T - stanice biti uklonjene iz vrha . T- stanice su dalje centrifugirane , supernatant je uklonjen , a mali alikvot se računa da se odredi vijabilnost stanica . Stanice su ili izravno koristiti za eksperimente ili zamrznuta za buduće korištenje .
Krioprezervacija

zamrzavanje reagensi su unaprijed pripremljena kako bi se izbjeglo propadanje T - stanica po sobi temperatura . Ako to nije moguće, stanice se drže na ledu i u hladnjaku . Reagensi se sastoje od stanične kulture medija i 10-13 posto humani serumski albumin ( HSA ), proteina , kao i medij za staničnu kulturu i 10 posto dimetil sulfoksidu ( DMSO ) . DMSO minimizira dehidracija, pH promjene , a promjene koncentracije elektrolita povezana s nule . T - stanice su ponovno suspendirane u reagensa koji sadrži medij za staničnu kulturu i HSA u epruvete otporne na niske . Reagens koji sadrži DMSO se polako doda u stanice i lagano zavrti . Stanice se zatim prenese u posudu koja sadrži smrzavanje izopropanola kako bi se osiguralo postupno smanjuje temperaturu i pohranjena .
Otapanja

kada je T- stanica su odmrznute ,epruvete otporne na niske ukloni iz skladištenja i inkubiraju na 37 stupnjeva Celzijusa . Nakon toga , odgovarajući otapanja medij polako je dodan stanicama do dvavolumena je postignut , presele se u odvojenu epruvetu , i centrifugira . Benzonaze ​​ponekad dodan otapanja medij kako bi se spriječilo stvaranje grudica mrtvih T - stanica . Centrifugira kuglica je odgovorio staničnih kultura medijima iodrživost stanica se procjenjuje . T- stanice su tada spremni za korištenje za odgovarajućim eksperimentima .