Određivanje aktivnosti kompetitivnim vezanjem Protokol

kompetitivnog vezivanja jeeksperiment koji određuje sposobnost vezanja proteina ili kemikalija za specijaliziranih proteina nalaze na površini stanica , zvanih receptora . Metoda se često koristi u medicinskim istraživanjima , ali je također u mogućnosti odrediti koji lijekovi vežu za receptore i mijenjati aktivnost receptora , što pak može promijeniti ponašanje stanica . Priprema stanica

resuspendiranje stanica u ledeno - hladnog fosfatnog pufera ( PBS ) . Mjerenje koncentracije proteina za potvrdu jednake razine proteina pomoću specijaliziranih komercijalno dostupan protein assay .
Ispitivanje

Dodavanje se radioaktivno - obilježeni protein poznato da se vežu na receptor , ligand , suspenziji stanica ili tkiva . Dodavanje natjecatelja koji je ispitivani lijek ili proteina u istraživanju i inkubirati s radioaktivnim ligandom i stanične suspenzije . Raspon koncentracija ispitivanog lijeka treba ispitati . Nakon inkubacije , zaseban vezane i nevezane ligand i mjeriti radioaktivnost .
Analiza podataka

uobičajena mjera koju treba utvrditi je polamaksimalna koncentracija da inhibira receptor inače poznat kao IC50 . To se izračunava crtanjem koncentracije na logaritamskoj skali na X osi grafa a Y-os predstavlja postotak inhibicije ; sigmoidna krivulja , što jeS - oblik , treba generirati . IC50 je50 posto točka inhibicije iodgovarajuća koncentracija može pročitati iz grafikona .